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적무 새싹 추출물의 3T3-L1 지방전구세포에서 지방합성 억제 효과
전주생물소재연구소, 영농조합법인 애농

적무 새싹 추출물(RRSE)의 α-amlyase, α-glucosidase 저해활성

건조한 적무 새싹(RRS) 10 g으로부터 증류수 추출을 통해 2.88 g의 추출물을 확보하였다(yield, 28.8%). RRSE의 α- amlyase 와 α-glucosidase 효소 활성억제 효능 분석결과 α- amlyase는 IC50 117.04 μg/ml, α-glucosidase는 IC50 48.93 μg/ ml에서 억제 효능을 나타냈다(Table 1). 탄수화물의 소화과정 에 관여하는 효소 중 α-amlyase는 타액 및 췌장에서 분비되는 효소로 starches나 glycogen의 α-glycogen을 glucose나 maltose 로 분해하고, 소장 상피세포에 있는 α-glucosidase는 탄수화물 소화의 중추적인 효소이다. 두 효소의 활성을 저해시킴으로써 탄수화물 소화 속도를 지연시키며 식후 혈당 상승을 억제할 수 있다[12]. Starches의 소화 흡수를 저해하는 저해제는 당뇨 병, 비만증, 과혈당증 등의 전분 흡수와 관련된 질병 치료제로 이용될 수 있다.

RRSE의 pancreatic lipase 저해활성

Pancreatic lipase는 triglyceride를 가수분해시켜 glycerol과 fatty acid으로 분해한다. 섭취한 지방은 lipase의 작용에 의해 주로 monoglyceride와 fatty acid로 분해되어 bile acid와 micelle을 형성해서 흡수된다. 흡수된 지방산은 소장상피세포에 서 triglyceride로 재합성되어 순환혈액 속에 들어가고 간장, 지방조직, 근육 등으로 보내져 사용되고 남은 triglyceride는 각 조직에 축적된다. 이때 지방의 축적이 과도하면 비만을 초 래할 수 있다. 지방 흡수의 중요한 역할을 하는 lipase의 활성 저해를 통해 지방이 체내에 소화, 흡수 되지 않고 체외로 배설 되게 함으로 지방의 축척을 막을 수 있다[8]. RRSE의 pancreatic lipase 저해 활성을 비교한 결과는 그림 Fig. 1에서 나타내었다. RRSE는 50~400 μg/ml 농도범위에서 처리하여 분석하였으며, Orlistat를 positive control로 사용하였다. 결과 Positive control인 orlistat (24.6±0.4%)에 비해 pancreatic lipase 저해활성이 우수하지는 않았으나, RRSE 처리 농도 중 가장 낮은 농도인 50 μg/ml (57.1±2.5%)에서부터 통계 적으로 유의한 억제 효능을 보였으며 농도가 증가할 수로 차 츰 억제 효능이 증가하는 경향이 있었으나 농도범위간 유의성 은 없었다.

RRSE의 3T3-L1 preadipocyte 분화 억제 활성

3T3-L1 preadipocytes에 IBMX, dexamethasone, insulin을 처리하여 지방분화를 유도하였으며 지방분화 저해활성을 측 정하기 위해 RRSE를 50~400 μg/ml의 농도범위에서 처리한 후 Oil Red O를 이용하여 생성된 지방의 양을 측정함으로써 지방분화에 미치는 시료의 효능을 판단하였다. 그 결과 MDI (339.3±0.07%)만 처리한 대조군에 비해 RRSE를 처리한 군에 서 농도가 증가할수록 lipid droplet 생성이 현저히 억제되는 것을 현미경으로 확인하였으며(Fig. 2A) 염색된 Oil red-O를 isopropyl alcohol로 추출하여 정량한 결과에서도 유의한 억제 효능을 확인하였다(Fig. 2B). 고농도인 400 μg/ml(172.7± 5.0%)을 처리한 군은 positive control로 사용한 orlistat (186.6 ±18.1%)와도 유사한 억제 효능을 보였다. Lipid droplet은 preadipocytes의 분화과정에서 생성되며 phospholipid monolayer에 둘러싸인 중성지방으로 구성되어 있으며, 중성지방인 triglyceride (TG)는 중요한 에너지원이나 과도하게 생성된 triglyceride는 지방세포에 흡수되고 저장되어 비만의 원인으 로 작용한다[5, 7]. RRSE를 처리하여 생성된 TG 함량을 측정 한 결과 100 μg/ml 이상의 농도범위에서 30% 이상 감소되는 것을 확인하였으며 최대 처리 농도인 400 μg/ml(9.8±0.9 μg/ mg)에서는 positive control인 orlistat (9.5±0.8 μg/mg)와 유사 한 감소효과를 나타내었다(Fig. 2C). 이러한 지방생성 억제 효 능이 지방세포에 대한 독성에 의한 것인지를 검토하기 위하여 MTT assay를 통하여 분화전과 분화후의 세포 생존율을 비교 하였다. 결과 분화 억제를 보인 농도를 포함한 모든 처리 농도 에서 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 2D, 2E).

RRSE의 adipogenic transcription factor 발현 조절 효능

Preadipocytes에서 adipocytes로 분화되는 adipogenesis 과 정은 많은 종류의 adipogenic transcription factor들의 regulation에 의하여 유도되는 것으로 알려져 있으며 이러한 분화 과정에서 가장 중추적인 역할을 하는 transcription factors는 CCAT-enhancer binding protein (C/EBP)α, Peroxisome proliferator- activated receptor (PPAR)γ, Sterol regulatory element binding protein (SREBP)이다. 이러한 transcription factor는 지질 생합성 조절, 세포내 지질의 축적 조절, glucose 흡수 조절 등의 기능을 하는데 필요한 유전자들의 발현을 조 절하여 분화를 유도한다[1, 3, 4, 16]. C/EBPα, PPARγ, SREBP 의 발현은 상호작용을 통하여 세포내 lipid droplet 생성 및 세포 비대 등과 같은 형태적 변형과 더불어 FABP4, FAS, perilipin, adiponectin 등의 adipocytokine과 adipogenic protein 발현에 중요한 역할을 한다[1]. 지방세포 분화 과정에서 RRSE 를 처리한 뒤 지방 세포에서 지방의 분화와 관련되는 유전자 의 발현을 Western blot analysis를 통하여 분석하였다. 그 결과 RRSE 처리 농도 200 μg/ml 이상에서는 C/EBPα, PPARγ, SREBP-1의 발현 증가를 유의하게 억제하였고, PPARγ의 발현 은 가장 낮은 농도인 50 μg/ml에서부터 억제 효능을 보였다 (Fig. 3). 따라서 적무 새싹은 지방분화 유전자의 조절을 통하 여 지방 생성 억제 효능을 나타낸 것으로 사료된다.

RRSE의 adipogenic protein 발현 조절 효능

지방세포 분화시 발현되는 transcription factor에 의해 유도 되는 down stream signaling 단백질로는 adiponectine, FAS, perilipin, FABP4 등이 있다. Adiponectin은 지방조직에서만 발현되는 것으로 알려져 왔으나, 최근 연구에 의하면 골수,조골세포, 태아 조직, 근육세포, 심근세포, 타액선상피세포에 서도 일부 발현되는 것으로 보고되고 있다. 하지만 성인에서 adiponectin이 가장 많이 생성되는 곳은 지방세포이다[17, 20]. FAS는 acetyl-coenzyme A와 malonyl-coenzyme A로부터 long-chain fatty acid를 생성하게 하는 효소이다. Perilipin은 lipid droplets의 periphery에 localization되어 있고 lipid storage에 주요한 역할을 한다. Chang [18] 연구팀은 perilipin 유 전자를 제거한 mouse는 지방을 축적하지 못하여 비만이 유발 되지 않음을 보고하였다. 이는 perilipin이 지방 세포내에 있는 지방질 분해효소(hormone-sensitive lipase, HSL)을 억제하는 작용에 의한 것임을 밝혔다. FABP4은 다양한 cellular pathway에서 지방산 혹은 지질과 binding하여 transport되도록 한 다. 최근까지 발표된 결과는 FABPs가 지방산 대사조절에서 핵심적인 역할을 할 수 있다는 사실을 보고하였다[10, 13]. 현 재까지 밝혀진 FABP family는 9개의 member가 있으며 이중 adipocyte FABP family는 FABP4 (adipocyte protein 2, aP2) 이다. FABP4 유전자를 제거한 obese diabetic mice (ob/ob)에 서 blood glucose level 감소와 insulin sensitivity 증가 및 plasma TG 와 cholesterol levels이 감소되었다고 보고되었다 [25]. 3T3-L1 분화시 RRSE를 50~400 μg/ml의ml의 농도로 처리한 뒤 Western bolt analysis를 통하여 adiponectin, FAS, perilipin, FABP4의 발현 조절능을 비교하였다. 결과, adipogenic transcription factor 발현 조절결과에서와 마찬가지로 200 μg/ml 이상의 도에서 adipogenic protein 발현이 감소하였다(Fig. 4). 이상의 결과는 적무 새싹이 지방합성을 유도하는 transcription factor와 transcription factor에 의해 조절되는 adipogenic protein 발현을 감소시켜 지방 생성과 축적을 억제하 는 효능을 나타낸다고 할 수 있다. 이러한 결과를 바탕으로 향후 적무 새싹을 이용한 기능적 특성을 함유하는 체중조절을위한 식품소재로의 활용도가 높을 것으로 사료된다.